Во Львове Фёдоров также столкнулся с большой конкуренцией со стороны переписчиков. После того, как в 1579 году его типография вместе со 140 книгами была заложена за 411 польских злотых, печатник уехал в город Острог, где напечатал по поручению князя Константина Острожского знаменитую Острожскую Библию, первую полную Библию на церковнославянском языке.
Острожская Библия напечатана в 1580–1581 годах и является первым изданным на церковнославянском языке полным сводом книг Ветхого (кроме Послания Иеремии) и Нового Завета. Для своего времени это был самый масштабный проект кириллического книгопечатания.
Источниками при подготовке издания стали рукописная Геннадиевская Библия, составленная в конце XV века при новгородском архиепископе Геннадии; Септуагинта и Вульгата (греческий и латинский тексты Библии), а также южнославянские кодексы, которые были привезены с Афона и из Сербии.
В работе над изданием, кроме Ивана Фёдорова, принимали участие также преподаватели Острожского славяно-греко-латинского коллегиума – Герасим Смотрицккий, Василий Суражский-Малюшицкий и др.
Кроме книг, составляющих Ветхий и Новый Завет, издание включает также вирши на герб князя Константина Острожского, предисловия в прозе и стихах на греческом и церковнославянском языках от имени Острожского, Ивана Фёдорова и Смотрицкого, месяцеслов, указатель евангельских чтений и послесловие печатника параллельно на греческом и церковнославянском языках.
Предполагалось, что Библия будет проиллюстрирована сюжетными гравюрами, как это было принято в западноевропейских изданиях. Но по ряду финансовых обстоятельств издание Острожской Библии обошлось без гравюр на меди, которые предполагалось изначально сделать в количестве 150 штук.
Издание украшено выполненными на дереве гравюрами с изображением герба Острожского, заставками, малой типографской маркой Ивана Фёдорова, концовками, инициалами и выполненными вязью киноварными заголовками. В оформлении титульного листа применена ксилографическая рамка, использованная ранее Фёдоровым при издании «Апостолов» 1564 и 1574 годов.
Острожская Библия – один из наилучшим образом сохранившихся памятников кириллического книгопечатания XVI века. От первоначального тиража, составлявшего не менее одной тысячи экземпляров, сохранилось около 350. На выставке представлено
факсимильное издание Острожской Библии, вышедшее в 1988 году.